圖1. 展示了黏連蛋白在DNA上的拓?fù)溲b載過(guò)程。研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通過(guò)全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡技術(shù)，觀察單個(gè)DNA結(jié)合的黏連蛋白復(fù)合體對(duì)外力的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中，研究人員將純化的黏連蛋白四聚體與λ-DNA結(jié)合，并通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)步驟，如鹽洗脫、限制酶切割等，證實(shí)了黏連蛋白與DNA之間的拓?fù)湎嗷プ饔茫答みB蛋白確實(shí)能夠以一種環(huán)繞的方式包裹DNA，并且這種包裹在高鹽濃度下依然穩(wěn)定。此外，通過(guò)使用SpyTag-SpyCatcher共價(jià)交聯(lián)系統(tǒng)，研究人員還證明了DNA在黏連蛋白環(huán)內(nèi)部被拓?fù)浒瑸楹罄m(xù)研究黏連蛋白環(huán)的機(jī)械穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。

圖2. 描述了黏連蛋白在受力情況下的解離行為。研究人員利用光鑷技術(shù)，對(duì)結(jié)合在DNA上的黏連蛋白施加外力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)力垂直于DNA方向作用時(shí)，黏連蛋白會(huì)強(qiáng)烈抵抗運(yùn)動(dòng)和脫離。通過(guò)收集力-距離（FD）曲線，研究人員觀察到黏連蛋白在約20pN的力下會(huì)發(fā)生突然的解離事件，并且這種解離事件是單步的，表明是單個(gè)黏連蛋白分子的斷裂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)通過(guò)黏連蛋白的不同部位（頭部或鉸鏈）施加力時(shí)，雖然解離力存在微小差異，但總體上解離過(guò)程都發(fā)生在相同的界面，即鉸鏈結(jié)構(gòu)域，這進(jìn)一步證實(shí)了鉸鏈?zhǔn)丘みB蛋白環(huán)中最薄弱的環(huán)節(jié)。

圖3. 進(jìn)一步探討了黏連蛋白環(huán)在不同交聯(lián)狀態(tài)下對(duì)外力的響應(yīng)。研究人員分別對(duì)Smc3Psm3-kleisin界面和鉸鏈結(jié)構(gòu)域進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，然后施加外力。結(jié)果表明，當(dāng)Smc3Psm3-kleisin界面被交聯(lián)時(shí)，黏連蛋白環(huán)在約20pN的力下仍然會(huì)發(fā)生解離，且解離參數(shù)與野生型黏連蛋白相似，說(shuō)明解離并非發(fā)生在交聯(lián)的Smc3Psm3-kleisin界面，而是鉸鏈結(jié)構(gòu)域。而當(dāng)鉸鏈結(jié)構(gòu)域被交聯(lián)后，黏連蛋白環(huán)的解離力顯著增加，出現(xiàn)了一個(gè)約70pN的解離峰，這表明鉸鏈結(jié)構(gòu)域的交聯(lián)使得黏連蛋白環(huán)的另一個(gè)較弱界面暴露出來(lái)，從而需要更大的力才能使其解離。這一發(fā)現(xiàn)揭示了黏連蛋白環(huán)在不同結(jié)構(gòu)域受到外力時(shí)的解離機(jī)制，即在正常情況下，鉸鏈結(jié)構(gòu)域是最先解離的薄弱環(huán)節(jié)，而當(dāng)鉸鏈被固定時(shí)，其他界面也會(huì)成為潛在的解離點(diǎn)。

圖4. 展示了單個(gè)黏連蛋白復(fù)合體能夠同時(shí)捕捉兩條DNA分子，并且這種DNA-DNA相互作用在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的。研究人員在已經(jīng)裝載有λ-DNA的黏連蛋白上添加了第二條單鏈或雙鏈DNA，發(fā)現(xiàn)黏連蛋白能夠?qū)⒌诙lDNA捕獲并與之形成穩(wěn)定的相互作用，這種相互作用在高鹽濃度下依然能夠保持穩(wěn)定，并且可以通過(guò)限制酶切割第二條DNA來(lái)證明其拓?fù)湫再|(zhì)。此外，研究人員還觀察到，這種DNA-DNA相互作用對(duì)ATP和黏連蛋白裝載蛋白Scc2Mis4–Scc4Ssl3存在依賴性，并且能夠被黏連蛋白卸載復(fù)合體Pds5Pds5–Wpl1Wapl所破壞，這表明在實(shí)驗(yàn)中觀察到的DNA-DNA相互作用具有生理相關(guān)性，類似于細(xì)胞中姐妹染色單體之間的黏連。

圖5. 研究了黏連蛋白在維持兩條DNA之間相互作用時(shí)的機(jī)械穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中，研究人員將第二條DNA通過(guò)生物素-鏈霉親和素的相互作用連接到光鑷的微珠上，然后對(duì)黏連蛋白施加外力，觀察DNA-DNA相互作用的破裂情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是單鏈DNA還是雙鏈DNA作為第二條DNA，其與第一條DNA之間的相互作用在約16pN的力下都會(huì)發(fā)生破裂，且破裂事件大多表現(xiàn)為單峰，這進(jìn)一步證實(shí)了單個(gè)黏連蛋白復(fù)合體在維持DNA-DNA相互作用中的關(guān)鍵作用。此外，研究人員還通過(guò)模擬計(jì)算解釋了為什么在DNA-DNA相互作用中測(cè)得的破裂力比直接對(duì)黏連蛋白施加力時(shí)測(cè)得的破裂力要小，這是因?yàn)楫?dāng)包含第二條DNA時(shí)，DNA的拉伸過(guò)程會(huì)占用更多時(shí)間，從而降低了有效的力加載速率，使得黏連蛋白更有可能在較低的力下發(fā)生解離。